Методика и воспроизводимость

0Идея модели

XPD (helicase-субъединица TFIIH) в ходе эксцизионной репарации нуклеотидов (NER) «верифицирует» повреждение: повреждённая одиночная нить ДНК продевается сквозь центральную пору XPD, в сужении между доменами FeS и Arch, и повреждение застревает у контрольной точки His135. Оксалиплатин образует 1,2-внутринитевой сшив d(GpG) — два ковалентных Pt–N7(гуанин) в плоскоквадратном Pt(II). Задача — получить трёхмерный комплекс XPD + Y-вилка дцДНК + Pt-аддукт + [4Fe-4S] в этой «верификационной» конформации, а затем сравнить, как разные Pt-аддукты меняют комплекс и, в частности, расстояние Pt → [4Fe-4S].

Итог во вьювере: 9 «запечатанных» структур сравнительной миссии (замороженный якорь + улучшенная база + 7 вариантов) плюс 1 ad-hoc follow-on (monoflip) — итого 10 CIF в одном селекторе 3Dmol.js. Все построены на одном фиксированном каркасе XPD/9PCP; между структурами меняется только Pt-аддукт.

1Программное обеспечение и версии

Железо: GPU-часть (Boltz) — арендованные ноды Vast.ai (RTX 6000 Ada / A6000, ≈$0.14 за прогон); CPU-часть (все минимизации/измерения) — hive3070T06 (56 vCPU / 125 GB). Пины окружения Boltz заморожены в setup_boltz_env.sh + boltz-env.lock.txt.

2Структуры-источники (PDB / CCD / UniProt)

Правило приоритета координат: экспериментальные PDB → идеальные CCD → построение de-novo. Геометрия Pt — всегда из PDB/CCD, никогда из SMILES (RDKit/openbabel плохо с плоскоквадратным d⁸).

2.1 Белок и каркас комплекса

2.2 Железо-серный кластер

2.3 Химия поражения (оксалиплатин, база)

2.4 Референсы Pt-аддуктов для 7 вариантов

De-novo варианты (S,S-окса, оба монофункц. оксалиплатина, оба DACP) не имеют PDB/CCD-подтверждения — повышенная неопределённость (зафиксировано).

3Последовательность действий (пайплайн)

Конвейер как он реально исполнялся. Исторические тупики (Route A/B) оставлены намеренно — они объясняют, почему финальный каркас именно такой.

Этап 0 — постановка и выбор движка

Не задача для ESM (только белок). Нужен all-atom ко-фолдинг. Выбран Boltz-2: MIT-веса (коммерчески чисто) + чистый путь связи «CCD-лиганд ↔ канонический остаток» для Pt–N7. (Утверждение «AF3 запрещает лиганд-полимерные связи» опровергнуто — запрещены только полимер↔полимер.)

Этап 1 — ко-фолдинг Boltz-2

Кодирование входа (build_input.py → boltz_input.yaml): 1 protein = P18074 + MSA; 2 dna (Y-вилка, не тупой дуплекс); сшитые гуанины — обычные DG, сшив через bonds; лиганды CCD 1PT и CCD SF4; сшив = 2 bond [L,1,PT]→[нить,i|i+1,N7]; FeS = 4 bond 1:1 Fe→Cys.SG. Запуск: boltz predict … --use_msa_server --diffusion_samples 5 (≥5 семплов). Раннер run_cofold.sh.

Находка №1: Boltz точно ставит белок и [4Fe-4S] (Fe→Cys 1.9–2.1 Å, каждый Fe 4-координатный), но роняет Pt–DNA-сшив (0/2 Pt–N7 во всех 5 моделях). pLDDT/PAE ≠ геометрия. Починка — прививка (Этап 5).

Этап 2 — проблема продевания нити

Находка №2: поражение «плавает» в 42–60 Å от поры; мягкий contact не протаскивает нить сквозь пору (топологический ход). Находка №3: по Yu et al. 2024 (9A88) нить продета через сужение FeS↔Arch, поражение у His135.

Route A (Boltz-шаблон 8REV + His135-контакты + прививка): химия проходит гейты, но направленность нити НЕВЕРНА (3′-конец не выходит к XPG; гейты не тестируют полярность). Route B (трансплант продетой ДНК 8REV): направленность идеальна (5′→3′ dot +1.00), но поражение ~17 Å от Boltz-кармана. Вывод: на гибриде — либо направленность, либо поражение-в-кармане.

Этап 3 — ре-граундинг на 9PCP

Дилемма решена переносом на 9PCP — напрямую определённый человеческий экспериментальный каркас, где сразу и белок, и продетая нить, и His135-регистр поражения в одном фрейме. Сборка (build_9pcp_complex.py, gemmi): chain B 9PCP → A (XPD); SF4 → S; повр. нить L → B; комплемент M → C; placeholder 1PT → L. Финальная одиночная модель — results_threaded/c9pcp_min.cif (честные 5/5 гейтов; она же — якорь frozen_base и модель на главной странице).

Этап 5 — прививка (graft) оксалиплатина из 1IHH

graft_routeB.py: жёстко-телесная трансплантация целого платинированного d(GpG) из 1IHH на два гуанина модели (суперпозиция по сахарофосфатному остову DG62/DG63). Прививка только Pt не работает. Итог: Pt–N7 ~1.94/1.98 Å, N7–Pt–N7 ~90°, CN=4. Регистр: B DG62(5′)/DG63(3′), фланги DT/DC (контекст «TGGC»).

Этап 6 — построение 7 вариантов

Единый билдер build_adduct.py (спеки JSON в specs/). Два режима: guanine_transplant (референс уже несёт платинированный гуанин: 1IHH или 4Q8E P9G — суперпозиция и перенос всей платинированной единицы; сфера верна по построению) и fragment_swap (изолированный Pt-фрагмент, напр. пикоплатин A1H58 из 9EO8, садится на донор-роли монофункц. шаблона по donor_map). RDKit — только органический скелет (кольцо DACP). CCD-координаты: curl files.rcsb.org/ligands/download/<CCD>.cif.

Этап 7 — минимизация (improved hybrid movable-carrier)

minimize_adduct*.py на OpenMM 8.5.1 (amber14 + неявный сольвент), на hive3070T06. Pt-аддукт и SF4 вынесены как частицы исключённого объёма (нет в amber-FF). Гибридный каррьер (--carrier-mode hybrid): жёсткая плоскоквадратная Pt-сфера удерживается рестрейнтом k≈1e5, органический скелет подвижен; для S,S — --lock-carrier-chirality (+ --k-ring 1e6). Термини ДНК amber14: +OXT, снять 5′-фосфат, удалить осиротевший OP1, резать на разрывах нумерации. Cys→Fe рестрейнится «наружу», чтобы все 4 Sγ сели, не слившись.

Этап 8 — измерение и конверт шума

Единый измеритель measure_complex.py: Pt–nearest-Fe, Pt–Fe-centroid, Pt–His135-NE2, координация, GpG-destack, пакеровка Кремера–Попла (Q), наклон ароматики, клэши. Независимая перепроверка — verify_pt_fes_independent.py. Конверт воспроизводимости: база переминимизирована идентичным протоколом из возмущённых (гаусс σ=0.05 Å на подвижные тяжёлые атомы; куб [4Fe-4S] не возмущается) и контрольных стартов → perturbed-2σ ≈ 0.039 Å, полный конверт ≈ 0.088 Å. Вердикт: |Δ|>конверт → REAL; ≤2σ → шум.

Этап 9 — валидационные гейты

validate_geometry.py (gemmi): (1) оба Pt–N7 ~1.95–2.05 Å, N7–Pt–N7 ~90° (проверено на 1IHH); (2) Pt 4-координатный плоскоквадрат; (3) куб [4Fe-4S] — каждый Fe CN=4, 1:1 Fe:Cys (проверено на 2FDN); (5) размещение в поре (soft WARN). Слепое пятно: полярность 5′→3′ не тестируется (урок Route A). Плюс адверсариальные проверки Zenith-миссии: обе линии 7/7; 15 VAL-* + 6 гейтов запечатаны.

Этап 10 — веб-вьювер

build_variants_manifest.py читает PT_FES_TABLE.json + per-variant *_measure.json, копирует 10 CIF в data/variants/ и пишет manifest.json. variants.html = селектор 3Dmol.js по семействам. Публикация: bash deploy.sh → Caddy.

4Локализация железо-серного кластера [4Fe-4S]

«Локализация» кластера прошла через несколько механизмов по мере эволюции каркаса; в финальной модели — комбинация нативного размещения из эксперимента + идеализации геометрии + жёсткого гейта.

Координирующие остатки. В человеческом XPD кластер координируют Cys116, Cys134, Cys155, Cys190 (полноразмерная каноническая нумерация P18074; эксп. свидетельство — PDB 6RO4). Рядом стоит His135 — контрольный остаток верификации (Cys134 и His135 — соседи). В ctXPD (8REV) эти цистеины = 115/133/154/189.

• (A) Локализация ко-фолдингом (Boltz). Кластер кодируется как CCD SF4 + 4 явных bond Fe→Cys.SG в бижекции 1:1. Критично: каждый Fe связывает ровно один Sγ (+3 мостиковых S). Boltz ставит кластер корректно сам (Fe→Cys 1.9–2.1 Å, каждый Fe 4-координатный). Индекс-гейт: утвердить, что остаток на каждом индексе — действительно CYS.
• (B) Локализация трансплантацией (историческая, route на 9A88). Кластер переносился из 8REV на человеческие Cys116/134/155/190. Вытеснено после ре-граундинга на 9PCP.
• (C) Нативное размещение (финал, 9PCP). Кластер нативен в 9PCP; при сборке (build_9pcp_complex.py) остаток SF4 копируется в отдельную chain S — отдельная локализация не нужна, только сохранение.
• (D) Идеализация геометрии куба (idealize_cluster.py, gemmi). Нативный куб 9PCP имеет верные позиции Fe (Sγ–Fe ~2.25 Å), но искажённый внутренний куб (одна Fe–S растянута до 3.88 Å — артефакт cryo-EM). Процедура: (1) найти куб в модели и в референсе 2FDN (4 Fe + 4 S); (2) спарить Fe модели↔референса ближайшим соседом в центроидном фрейме (вершины взаимозаменяемы → жадное сопоставление); (3) суперпозиция Кабша (gemmi.superpose_positions) чистого куба 2FDN на 4 Fe модели; (4) заменить chain S трансформированным чистым кубом. Итог: позиции Fe почти не двигаются (координация Sγ–Fe сохранена, 2.13–2.42 Å по 4/4 Cys), но внутренние Fe–S/S–S становятся физиологичными (~2.2–2.4 Å).
• (E) Валидационный гейт FeS (validate_geometry.py). Для каждого Fe в пределах FE_COORD_CUTOFF = 2.7 Å: исключить металл-металл (Fe–Fe ~2.7 Å); считать координацию по сере (3 мостиковых S + 1 Cys.SG); требовать CN=4 и ровно один Cys.SG. Откалибровано на 2FDN.
• (F) Роль в минимизации и сравнении. При минимизации SF4 держится как фиксированный объём исключения, Cys→Fe рестрейнится «наружу». В сравнении весь куб (chain S) заморожен как фиксированная опора измерения Pt-расстояния — не возмущается даже в noise-envelope, поэтому Pt→[4Fe-4S] дельты отражают только химию аддукта. Ближайший Fe во всех структурах — S:FE3.

5Ключевой результат (Pt → [4Fe-4S])

Компаратор — улучшенная база оксалиплатина R,R (Δ≡0). Вердикт по Pt–nearest-Fe: |Δ|>0.088 Å = REAL; ≤0.039 Å = шум.

Главный вывод: только два объёмных монофункциональных аддукта — фенантриплатин (Δ−0.223 Å) и пикоплатин (Δ−0.218 Å) — реально придвигают Pt к кластеру [4Fe-4S] (за пределами конверта шума). Все стерео (R,R↔S,S), моно-vs-би и контракция DACH→DACP — в пределах шума. Отдельно: сделать гуанин не-стэкающимся (follow-on monoflip, ATG*T, глициозидный флип −35°) — первое одиночно-гуаниновое изменение, двигающее Pt–[4Fe-4S] на реальную величину (+0.698 Å, т.е. дальше от кластера).

6Ограничения и оговорки

• Нет экспериментальной ко-структуры «человеческий XPD + Pt-внутринитевой аддукт» — весь набор — гипотезы на фиксированном экспериментальном каркасе XPD.
• De-novo варианты (S,S-оксалиплатин, монофункц. оксалиплатин R,R/S,S, оба DACP) не имеют PDB/CCD-подтверждения.
• Гейт-слепота: полярность 5′→3′ не тестируется; pLDDT/PAE ничего не говорят о геометрии металла.
• Boltz-лимиты: ковалентная связь лиганд→ДНК роняется движком (отсюда прививка); шаблоны Boltz — только для белкового остова (ДНК/лиганды в шаблоне игнорируются).
• Компаратор: все дельты — против улучшенной базы, чтобы отделить химию аддукта от смены метода. Точные длины Pt–N (CCDC 875229; CSD) за пейволлом → берутся координаты PDB/CCD, а не числа.

7Литература (сверять ID перед цитированием)

Биология XPD / верификация / His135 / продевание

• Yu, Yan, Paul, Brewer, Tsutakawa, Tsai, Hamdan, Tainer, Ivanov. «Molecular architecture and functional dynamics of the pre-incision complex in NER». Nat Commun 15:8511 (2024). DOI 10.1038/s41467-024-52860-y; PMC11445577. PDB 9A88.
• Li / Kim / Brussee et al. (человеческий pre-incision NER, lesion-verification). Nature 652:1060 (2026). DOI 10.1038/s41586-026-10122-5. PDB 9PCP. (свежая — сверить)
• Референсы фолда/поры: PDB 6RO4, 6NMI, 5OF4, 4A15; шаблон продевания — PDB 8REV / EMD-19109.

Химия оксалиплатин-d(GpG) и энантио/секвенс-зависимость

• Spingler, Whittington, Lippard. Inorg Chem (2001) — X-ray оксалиплатин-GG, PDB 1IHH.
• Wu … Chaney. J Mol Biol (2004) — ЯМР 1PG9/1PGC (AGGC).
• Delalande, Kozelka. Biophys J (2005) — MD: оба энантиомера образуют обе NH···O6 связи.
• Malina, Natile, Brabec. Biophys J (2007), PMID 17704160 — стерическая секвенс-зависимая энантиодифференциация.
• Цисплатин-компараторы: PDB 3LPV, 1AIO, 1A84.

Варианты аддуктов

• Wang, Lippard. PNAS (2010) — пириплатин, PDB 3M3Y/3M4O, CCD C7P.
• Park et al. PNAS (2012); Gregory et al. PNAS (2014) — фенантриплатин, PDB 4Q8E/4Q8F, CCD P9G.
• Merlino. Dalton Trans (2024); Sadler et al. Inorg Chem (2005) — пикоплатин CCD A1H58 в PDB 9EO8.

Кластер [4Fe-4S] и движки

• Ферредоксин Clostridium, PDB 2FDN — референс идеального куба + калибровка FeS-гейта. Координирующие Cys116/134/155/190 XPD — UniProt P18074 (эксп. свидетельство PDB 6RO4).
• Boltz-2 (веса MIT) — репозиторий кода github.com/jwohlwend/boltz (версия 2.2.1). MSA — сервер MMseqs2. Минимизация — OpenMM 8.5.1 (amber14).

8Код и файлы

Основной пайплайн — /root/xpd-oxaliplatin-cofold/

• Документация: RECIPE.md, MISSION_MEMORY.md, VARIANT_SOURCES.md, decisions/variant-*.md, specs/README.md, REPRODUCIBILITY.md (полная версия этой страницы).
• Окружение/запуск: setup_boltz_env.sh, boltz-env.lock.txt, run_cofold.sh, вариантные run_*_hybrid.sh.
• Вход/сборка: build_input.py, boltz_input*.yaml, build_9pcp_complex.py, build_routeB.py, build_adduct.py (+ specs/*.json), ccd_to_cif.py, pico_fragment_from_9eo8.py, mutate_base.py, flip_lesion.py.
• Прививка/кластер: graft_lesion.py, graft_routeB.py, idealize_cluster.py.
• Минимизация: minimize_adduct*.py, minimize_9pcp.py, declash_protein.py.
• Измерение/гейты: validate_geometry.py, measure_complex.py, measure_pt_metal.py, hbond_analysis.py.
• Референсы (скачаны): ref_9PCP.cif, ref_9A88.cif, ref_8REV.cif, ref_1IHH.cif, ref_2FDN.cif, ref_variants/{4Q8E,9EO8,3M3Y,A1H58,C7P,P9G}.cif.
• Результаты: results_threaded/c9pcp_min.cif и results_variants/ (SYNTHESIS.md, PT_FES_TABLE.{md,csv,json}, noise_envelope/, per-variant */*_min.cif + *_measure.json).

Вьювер — /root/biometal-xpd-viewer/: variants.html, index.html, hbonds.html, methods.html; build_variants_manifest.py; data/variants/; deploy.sh.

9Быстрый старт для полного воспроизведения

# 1) Окружение Boltz на GPU-боксе (Vast.ai; NOT hermes — здесь нет GPU)
cd /root/xpd-oxaliplatin-cofold
bash setup_boltz_env.sh                 # пины из boltz-env.lock.txt

# 2) Ко-фолдинг (P18074 + Y-вилка ДНК + CCD 1PT + CCD SF4 + bond-констрейнты)
python build_input.py                   # -> boltz_input.yaml
bash run_cofold.sh                       # boltz predict --use_msa_server --diffusion_samples 5 -> гейт

# 3) Финальный каркас из 9PCP + прививка оксалиплатина из 1IHH + идеализация куба
python build_9pcp_complex.py             # -> results_threaded/c9pcp_assembled.cif
python graft_routeB.py                   # ставит Pt-d(GpG) на B62/63
python idealize_cluster.py results_threaded/c9pcp_grafted.cif results_threaded/c9pcp_ideal.cif --ref ref_2FDN.cif
# минимизация на hive3070T06 -> results_threaded/c9pcp_min.cif (frozen base)

# 4) Варианты: единый билдер по спеку + гибридная минимизация (пример — фенантриплатин)
python build_adduct.py specs/phen.json   # guanine_transplant из 4Q8E/P9G
bash run_phen_hybrid.sh                   # minimize_adduct.py --topology monofunctional --carrier-mode hybrid

# 5) Измерение + таблица + конверт шума + вердикты
cd results_variants && ../.venv/bin/python build_pt_fes_table.py
python verify_pt_fes_independent.py
bash noise_envelope/run_noise.sh

# 6) Гейты
cd /root/xpd-oxaliplatin-cofold
./.venv/bin/python validate_geometry.py results_variants/phen/phen_min.cif --pore 158,161,192,193,196 --protein-chain A

# 7) Публикация вьювера
cd /root/biometal-xpd-viewer
python build_variants_manifest.py
bash deploy.sh                            # -> Caddy /var/www/xpd-cofold